PCR常见问题总汇

发表于 2018-6-11 22:01:15

PCR常见问题总汇

PCR 产物的电泳检测时间
一般为48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④
PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq 酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化
除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸
变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核
酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更
改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导
致假阴性。需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不理
想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条
浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓
度不仅要看OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两
引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，
应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失
效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特
异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR 扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用
多大体积进行PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，
再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出
现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物
与模板的结合而降低PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水
溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段
缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR 扩增是不会成功的。

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发表于 2019-3-16 22:42:08

這麼好的帖子都沒有人頂！d=====(￣▽￣*)b，我來多頂頂樓主

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