超临界流体色谱法的几个应用合集

仪器资料 · 发表于 2017-6-26 10:22:46

超临界流体色谱法的几个应用合集

超临界流体色谱法分析大豆磷脂
来源: 作者:王学军，赵锁奇，王仁安
摘要：采用以CO2为流动相的超临界流体色谱方法，以含0．05％(体积分数)三乙胺的乙醇作为改性剂，对具有重要生物功能的大豆磷脂组成进行分析，获得了大豆磷脂提取物中6个重要组分的定性结果，并讨论了流动相组成、操作温度和压力对分离的影响。对其中有代表意义的磷脂酰胆碱(PC)进行了外标法定量分析，在PC质量浓度为0．020 g／L-0．075 g／L时具有较好的线性关系，PC加样回收率为96.7％( =5)，重现性好。此方法可用于实际样品的分析。
关键词：超临界流体色谱；磷脂酰胆碱；大豆磷脂
2 实验部分
2．1 仪器与试剂
所用SFC装置由本实验室设计组装而成。Rheadyne进样器配有lOμL的定量管，Spectra 100可变波长紫外检测器为美国TSP公司产品，色谱信号由色谱工作站记录。无水乙醇、三乙胺均为国产分析纯试剂。PC，PE，PI标准品购自Sigma公司大豆磷脂分别为本实验室超临界流体抽提萃取物和北京化学试剂公司产品。
2．2 色谱条件
参考文献[2，7，8]所报道的内容，本实验所用色谱柱选择Sphefisorb C18 10μm(中科院大连化学物理研究所)，250 mm×4．6mm i．d．不锈钢柱；流动相为超临界CO2和改性剂(体积比为10：1)，其中改性剂为含0．05％(体积分数)三乙胺的乙醇溶液；流动相流速为1．1mL ／min～1．3 mL／min；柱温为3O℃～60℃ ；压力为20MPa～30MPa；进样体积为10μL；经紫外扫描，选择检测波长为214nm。
2．3 混合标准溶液和样品溶液的制备
称取各磷脂标准品适量，加人同一容量瓶中，加乙醇至刻度，配成标准品的混合溶液，其中每一标准品的质量浓度均在0．2 g／L到10．0 g／L之问；分别称取两种大豆磷脂样品1．0 g，并各自配成质量浓度约为50 g／L的乙醇溶液。

3 结果与讨论
3．1 色谱峰归属
以PE，PI和PC 标准品确定图1中的2，3，7号峰分别为PE，PI和PC ，与文献图谱 [3,9,10]比较确定4，5，8号峰分别为PS，PA和Lyso-PC。其中标准品的谱图(图l-a)中峰1为溶剂峰，粗品的谱图(图1b)中峰l则为中性脂(包括胆固醇、甘油脂等1和溶剂的合峰.
3．2 流动相组成对分离的影响
由于超临界CO2，对极性物质的溶解能力较差，在对极性化合物进行分析时往往需在其中加入极性有机溶剂(称改性剂或携带剂)，增加流动相的溶解能力．但只用乙醇作改性剂时，分离效果难以令人满意(见图2)。当在乙醇中加入极少量的强极性物质时，分离能力有很大提高，并对峰形有较大改善。本实验采用加入0．05％三乙胺的乙醇作改性剂。
容量因子k’可以衡量化台物在固定相上保留值的大小。改性剂在流动相中的含量对分离的影响是非常明显的，即较高的改性剂浓度可缩短分析时间，但降低了相邻组分的分离选择性。
随着改性剂在流动相中的比例的提高，流动相的溶解能力加强，溶质的保留时间变短，在改性剂含量达到30％时已不能将PE与PI有效分离。
3．3 温度对分离的影响
一般情况下、温度的升高一方面会使溶质在固定相上吸／脱附加快，从而使溶质保留时间缩短；另一方面会使流动相的密度减小，而使溶辩能力减弱，溶质保留时间延长。保留时间的表观改变是两方面综合效果的体现。
如图4所示，在25 MPa、30℃ ～60℃ 时、升高温度会使各种磷脂的保留时间缩短但随着温度的升高、这种影响越来越小，表明温度对流动相密度减小的影响在逐渐增大。值得指出的是，在30℃(低于流动相的临界温度)时也可把各磷脂分开，表明在近临界状态下，超临界流体色谱也有良好的分离能力。
3．4 压力的影响
在二氧化碳和乙醇的体积流量比一定的情况下，尽管系统压力的升高引起了流动相中乙醇含量的微量减少，但流动相组成的微弱变化没有掩盖压力对溶质保留值的影响趋势(见图5)，即升高压力减小溶质的保留值，表明压力对溶质的保留时间的影响比较明显。
3．5 PC标准曲线
准确称取20mg PC标准品置于10mL容量瓶中，用乙醇定容。再用乙醇稀释，得到浓度分别为10mg／L，25mg／L，50mg／L，75 mg／L和100 mg／L的系列标准溶液。以上溶液均需新鲜配制。
外标峰面积定量法测定PC含量。结果表明当进样量为10 uL时，在PC质量浓度在0．020 g／L～0．075 g／L范围内，峰面积y与PC的含量x(μg)呈良好的线性关系：Y=1．187OX一0．0046，r=0．999 4。最低检出量为0．2μg(信噪比为3．5)。
3．6 PC加祥回收与重现性实验
取0．1 g大豆磷脂，精确称定，以乙醇定容为l0mL，平分为两份，其中一份加入2 mg PC标准品。用超临界流体色谱测定两份样品中的PC含量，计算加样回收率为96．7％(n=5)。其相对标准偏差(RSD)为2．8％( =5)。
3．7 应用
分别对本实验室的大豆磷脂超临界流体抽提萃取物和北京化学试剂公司的大豆磷脂产品进行了外标法测定其中本实验室的萃取物中PC含量为53％(质量分数)，北京化学试剂公司的大豆磷脂中PC 含量为34％(质量分数)
4 结论
采用超临界流体色谱法，在适当的色谱条件下，分离了6种极性不同的磷脂，并对其中有代表意义的PC 进行了定量分析本方法快速、简便、重现性好，可用于超临界流体萃取大豆磷脂过程中PC含量的监测以及磷脂产品的分析测定。

仪器资料 · 发表于 2017-6-26 10:23:24

超临界流体色谱法测定固体在二氧化碳中的溶解度
来源: 作者:赵锁奇，杨光华，王仁安
摘要：开发了一种测定超临界二氧化碳中大分子溶质的溶解度的方法这一方法将微型超临界流体萃取(Micro-SFE)直接与超临界色谱(SFC)相耦合．超临界流体色谱采用FID作为检测器，实验中两者具有阿一压力、温度及同样的CO流速。使用了模型溶质萘、联苯和菲来验证此方法，井得到了温度在308～330K．压力8.0～12.0MPa间溶质的等压溶解度曲线，实验结果与文献值相符，定量显示了在溶剂近临界区域固体／超临界流体二元系的相平衡特性这一方法适用于重溶质在CO2中溶解度的测量。
关键词：固体；溶解度；二氧化碳；超临界流体萃取；超临界流体色谱
l 前言
近二十年不少研究者发表了相当数量的超临界流体中不同固体的平衡溶解度数据，常用模型化合物来考察温度、压力和超临界流体的密度对溶解度的影响．并用以建立超临界流体相平衡的理论。二氧化碳因其不可燃、无毒且价格低廉的特性成为最为常用的溶剂，而且二氧化碳有相对低的临界温度(31.2℃)和临界压力(72.9atm)，显然有利于热敏性物质的分离。
Francis测定过25℃下近临界二氧化碳中数百种溶质的溶解度．Tsekhanskaya等测定了超临界二氧化碳中固体萘的溶解度。McHugh发表了超临界CO2中萘和联苯的溶解度数据，Kurnik ，Schmitt和Reid则测定了包括CO2在内的超临界流体中数种有机化合物的溶解度数据。他们的工作中所用的仪器主要为中型的动态超临界流体萃取器。King，McHugh对超临界流体相平衡的静态和动态测定方法作了详细的评述。Bruno综述了溶质溶解度的四种测定方法，即动态流动法、静态(平衡)法、色谱溶解度法和光谱法。
超临界流体色谱使用超临界流体作为流动相，起源于六十年代，自八十年代中期开始得到迅速发展，但主要是用于分析工作。八十年代超临界流体色谱开始用于测定热力学性质，如两相中溶质的偏摩尔体积和偏摩尔焓、固定相与流动相之间溶质的分配系数Staeh使用超临界流体萃取和薄层色谱来测定超临界流体中固体的溶解度，这对测定溶解度的压力闽值并获得密度变化对溶解度的影响的定性说明，无疑是有益的Saito和Skelton等报道了直接耦合的超临界流体萃取／超临界流体色谱，这一类系统使用紫外检测器，利用紫外吸收来测定复杂物质的溶解度，对无紫外吸收的溶质就显得无能为力了。Smith等将毛细管超临界流体色谱与质谱联合用于测定溶液中溶质的量，这种方法可以对宽范围的固体样品作出较快的测量，但难于用于液体样品。Battle等作了若干超临界流体色谱中溶质的保留机理的假设，以此为基础测定了固体芳烃的溶解度。
相对于中型的超临界流体萃取来说，微型超临界流体萃取具有一定的优越性，如它便于建造和操作，所用样品量少．操作费用低，而且可以直接与分析仪器相衔接．如紫外、红外、核磁共振仪、质谱等．所用操作时间少。
本文的目的是发展一种直接测定大分子固体或液体在超临界流体CO2中溶解度的新方法，该方法应较为简便地确定稀溶液范围内的定量结果。研究中建立了将超临界流体微萃取与超临界流体色谱系统直接连接到氢离子火焰检测器(FID)的实验装置，之所以选择氢离子火焰检测器是因为它是一种通用型宽线性范围的检测器，比起其它检测器．如TLC和紫外检测器，它有较高的灵敏度。实验选择了萘，联苯和菲作为模型化合物来验证方法的可靠性并研究这三种溶质-二氧化碳体系在超临界区的相平衡特征。
2 实验
2．1 仪器
实验仪器的流程图。加冰浴的超临界流体色谱柱塞泵由二氧化碳气瓶供气，泵的最大工作压力为35.0MPa，出口压力由安装在泵内的微型计算机控制，压力信号由一个压力传感器传送到计算机，其控制精度为士0.02MPa。装有160～200目的氧化铝预柱用来预热二氧化碳并进一步纯化。进样阀为1微升的Rhoedyne7520进样阀。SFC柱尺寸为150×4.6 mm，装填有20～30μm的二氧化硅颗粒。微型SFE萃取器是与SFC柱同样尺寸的填充柱。SFE出口与进口的压力由Heise Bourdon压力表测量．测量范围25MPa，精度为士0.1。柱箱的温度由ShimadenFP21可编程控制器来测量并控制，已校准至士0.1K。系统中CO2的流量由插入FID的阻力器来调节到FID的正常工作流量，即常温常压下气体流量为25～35cm3／min，所以对不同的操作压力使用了一系列的阻力器。C02的流量由皂膜流量计测量常压(大气压力计测量)下FID出口经冷却到环境温度的流量。所用SQ-204型FID由北京分析仪器厂生产，其线性范围大于1000000，检测限低于4×0.00000000001g／sec。F1D输出信号送至色谱工作站并进行处理。
2．3 溶解度的测量
实验过程中系统保持温度、压力恒定．SFC柱和微型SFE均置入色谱柱箱溶质被载于二氧化硅或氧化铝上并装入萃取器。在标定时，阀4处于关闭状态，CO2经阀5流经预柱7进入高压进样阀l0，20 C的lul正庚烷。由进样器注入系统中，如气相色谱一样，正庚烷在此处用作标准物。标准物由溶剂携带经六通阀12进入色谱柱最终进入FID。在FID中标准物产生的输出信号进入色谱工作站，由色谱工作站记录信号并进行积分处理。标定一般进行3至5次，取峰面积平均值，其误差在l%之内，在溶质浓度测量时，打开阀4关闭阀5，CO2流经阀4至三通阀6进入预柱7及萃取柱8。萃取柱中的溶质被溶解出来并经六通阀12直接进入FID，FID产生的信号输出到色谱工作站，待溶质响应信号达到稳定平衡值后由色谱工作站计取样起始及结束时间．并计算取样面积。取样时间的大小并不会影响溶质浓度的计算，因为需要知道的是单位时间的峰面积．只要有溶质的质量校正因子就可以确定溶质在FID线性范围内的平衡浓度在取样结束后将三通阎6从图示位置切换到另一通路可将革取柱8以后的系统用溶剂清扫干净以便于下次标定操作实验过程中发现溶质的响应信号能很快达到稳定的平衡值 FID的温度设置为300"C，阻力器插入FID的深度调整至合适的深度以防止阻力器中溶质的沉积。众所周知．FID相应信号与H 、O 和载气的流量密切相关．但本实验中流量均由阻力器控制，因此实验过程中流量并不发生变化。在标定和溶解度测定时保持相同的操作条件，可以得到精确的标定值。由溶质的取样响应面积及时间，标准物正庚烷的峰面积可计算溶质的平衡质量流率。
2．4 校正因子的测量
要得到准确的溶解度数据．对每一种溶质都必须得到实测的校正固于。其方法与溶解度的确定类似，只是SFE柱中载有已知质量的溶质，所取的积分面积为对应所有溶质量的整个梯形面积。溶质量使用SartoriusA200S型天平称准至0.01mg。
3 结果与讨论
分别为萘和联苯在CO2中的溶解度数据，图中右上图例给出本文测定的各等压线的压力值及符号。作为比较，图中标出了文献中相近条件下的数据，数据点的温度和压力条件在图以下列出。菲的数据示于表。实验中对氧化铝和二氧化硅的吸附效应对溶解度的影响进行了考察，发现不存在吸附效应对平衡的影响。重复实验的再现性好，平行实验误差在3%之内，这一误差与其它方法相当。而与传统流动法相比，这种方法突出的优越性之一是随溶解度降低，实验误差并不增加。实验所得萘的溶解度数据与文献中的数据的差别在5%～1O%以内，菲的实验溶解度与文献的数据相差lO%。由此可以发现在温度效应非常显著的区域作溶解度数据的对比是非常困难的，除非采用的实验条件完全相同。
本方法可以较快得到溶解度的定量数据，与Saito的微萃取色谱法相比．该方法在实验程序上非常简单，实验过程中没有样品的收集和转移这样导致实验误差的步骤特别是在低浓度条件下．溶质直接进入FID而不需用六通阀取样再经过色谱柱，因而没有信号衰减的问题。根据本实验中所应用的FID灵敏度和线性范围，这一方法可直接测定的溶质浓度的上限为质量分数<1 。这种浓度范围在重质固体的溶解度测量中是常遇到的情况。这种方法从理论上讲可应用范围最低限是质量分数。在本实验中应用的浓度下限是质量分数。在这种情况下溶质的响应信号依然很强，所以该方法尤其适合于稀溶液。这也是大分子物质超临界液体萃取分离中经常遇到的情况本方法容易推广到测量液体在超临界CO2中的溶解度。采用本实验方法具有简便、快速及节省费用的优势。
实验选在CO2的超临界区，在此区域发现温度和压力对固体在超临界流体中的溶解度有显著影响。前人的工作多考察了高压区的压力效应。近来几个研究组对反常汽化和交叉现象进行了研究，但对溶质溶解度随温度降低而增大的反常汽化(冷凝)区中溶质溶解度与温度的定量关系并没有进行研究。本文中对影响固体-超临界流体相平衡的温度效应作了定量考察，若温度稍有差别，溶质的溶解度就可能发生很大的变化，压力越靠近临界压力．温度效应越显著。在近临界区(反常冷凝区)萘和联苯具有相似的溶解度等压线，相同温度压力条件下联苯溶解度略小于萘，而菲的溶解度约低一个数量级。
4 结论
阐述了一种测量有机固体在超临界CO2中溶解度的新方法，这一方法采用超临界流体微萃取-超临界流体色谱相耦联．用高灵敏度的FID作检测器，应用这一方法成功地测定了三种模型溶质萘、菲、联苯在CO2中的溶解度。实验结果显示了固体／超临界流体二元系在倒退冷凝区的溶解度随温度变化的特征这一实验方法具有速度快、样品用量少、灵敏度高，对于大分子有机物有很好的应用前景，在较低的浓度范围内特别有用。

仪器资料 · 发表于 2017-6-26 10:23:46

超临界流体色谱法测定三七及云南白药中人参二醇和人参三醇的含量
来源: 作者:李云华,李修禄,虹岚,刘锦耀,张美义
提要:本文用超临界流体色谱法(SFC用定了三七和云南白药中人参二醇及人参三醇的含量，使用15％硫酸乙醇-水(1 ：1)直接进行水解，然后碱水解，克服了文献报道的水解不完全、结果不稳定．不能定量回收的缺点。本法取样量少，灵敏度高，操作简单，快速．整个分析过程可在8h内完成
关键词：超临界流体色谱：人参二醇：人参三醇：三七：云南白药
三七(Radix notogimeng)为我国名贵中药，其主要有效成分为人参皂甙，经强酸水解得到人参二醇(panaxadio1)和人参三醇(panaxatrio1)。三七及其中成药的质量控制一直是个难题，目前测定人参二醇及人参三醇的方法还存在不少问题：薄层层析的分离度不够理想并有杂质干扰：气相色谱法需要衍生化，操作复杂：高效液相色谱也需要衍生化。我们采用将样品直接强酸水解后用环己烷提取，经净化后，用超临界流体色谱法测定了三七及其中成药中人参二醇及人参三醇的含量，获得了较好的结果。
实验部分
一．仪器和药品
622型SFC—GC 色谱仪(美国理氏科学仪器公司)：HP 3390A 色谱数据处理机：SB-Cyanopropyl-50石英毛细管交联柱10m×50μm，膜厚0.25μm。
人参二醇和人参三醇对照品购自中国科学院昆明植物研究所：三七粉、云南白药由昆明43医院药局提供。胆固醇为Merck公司产品，无水乙醇、二硫化碳、氢氧化钠，硫酸，环己烷均为分析纯试剂。
二．色谱条件
流动相为CO2，纯度99.995％；FID 检测器，检测器温度300℃ ；柱温90℃ ；分流进样，进样量0.2μl分流比为l／1O：起始压力为lO.1MPa，程升1.01MPa／min至35.5MPa。记录仪参数：ZER0=0， ATT=2，CHT SP=0.4，THRSH=4，PK WD=0.2。

三．水解、提取、净化条件
样品加l5％硫酸乙醇-水(1：1)10ml，精密加内标溶液(胆固醇的无水乙醇液lmg／ml，lml，水浴中回流水解4h，再加入l5％氢氧化钠溶液l5ml至强碱性，回流0.5h，冷却．用环己烷提取3次，每次l0ml。提取液经过1.5g硅藻土一水柱，除去少量乙醇及水溶性杂质，用环己烷5ml洗涤水柱，然后再经过0.3g硅胶H柱保留人参二醇，人参三醇和内标等，弃去环己皖，用3ml无水乙醇洗脱。
四．标准曲线的绘制
分别精密吸取人参二醇、人参三醇的无水乙醇溶液(均为lmg／m1)0.5，l，2，4ml，准确加内标溶液lml，加入15％硫酸乙醇-水(1：1)l0ml经上述水解、提取、净化后，挥去溶剂乙醇，用4ml二硫化碳溶解，取0.2μl进样SFC分析，分别计算人参二醇和人参三醇与内标的峰面积比，以峰面积比(Y)对相应的人参二醇或人参三醇的量(X)进行回归，回归方程为：
人参二醇：X=1.6l3Y+0.029 r=0.9999
人参三醇：X=1.538Y+0.322 r=0.9992
人参二醇或人参三醇的量(0.5～4.0mg)与峰面积比成线性关系。
五．加样回收率
精密称取三七粉0.1g或云南白药0.5g，加入人参二醇和人参三醇各lmg，同上经水解，提取、净化后，进行SFC分析，计算加样回收率。
六．检测限
以信噪比为3：1计算，人参二醇的最小捡测量是3.97×0.000000000001g，人参三醇的最小检测量是4.17×0.000000000001g。
七．样品分析
精密称取三七粉(80目，昆明大观制药厂)约0.1 g，云南白药(云南白药厂8906—09)约0.5 g，经上述水解，提取，净化后，挥去乙醇，用二硫化碳4ml溶解，取0.2μl进样SFC分析，计算人参二醇和人参三醇与内标的峰面积比，代入回归方程计算含量。结果：三七中含人参二醇及人参三醇分别为1.92±2.10(CV)％及2.71±1.36(CV)％；云南白药中含人参二醇及人参三醇分别为0.212±2.56(CV)％及0.285±2.79(CV)％。
讨论
三七粉及云南白药中无十扰内标的杂质峰。
人参二醇和人参三醇在酸中加热不稳定，因此绘制标准曲线时也需要经过水解，提取等操作。
本法用强酸强碱水解较完全，测得人参二醇及人参三醇的含量较文献法高。本法取样量少、灵敏、简便、快速，操作全过程可在8h内完成，为三七及云南白药中人参皂甙元的测定提供了较好的方法。对三七资源的研究及制剂的质量控制将有促进意义。
为了减小死体积，缩小溶剂峰，超临界流体色谱多采用分流进样。由于分流比不太稳定，目前很难用计算法定量，必须用内标法。分流比不稳定可能是样品中不挥发成分沉留在分流管壁上所致。有时分流管堵塞，可用热吹风吹通。每次进样前分流管用电吹风吹2min，分流比相对稳定。
因SFC流动相中的流动速度比GC慢，使用FID检测器溶剂峰较大。要使溶剂峰与组分分开，就要延长分析时间。我们将乙醇换成二硫化碳作进样溶剂，因二硫化碳在FID中的响废值小，溶剂峰很小，缩短了分析时间，使之在20min左右完成，可以作为常规分析。使用FID检测器．对中药及中成药中的有机成分有很高的检测灵敏度，不仅可以测定中成药中已知的有效成分，还可以测出来知成分作指纹鉴别，如云南白药的SFC图。因此SFC作中成药的质量控制是较好的手毁，有很大发展潜力。

仪器资料 · 发表于 2017-6-26 10:24:09

超临界流体色谱同时测定维生素B2，B3和烟酰胺
来源: 作者:郭亚东
摘要：采用超临界流体色谱同时定量测定维生素制剂中维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸)和烟酰胺的含量。在CO2流动相中添加15％(体积分数)的甲醇(含0.1％二乙胺)，于填充柱上分离，检测波长为268nm。上述3种维生素在测定范围内，其浓度与相应的峰面积呈良好的线性关系(r>0.999)，平均回收率为97.3％～102.3％；5 min即可完成分析。其日内和日间峰面积测定的相对标准偏差(RSD)小于1.5％。该方法简便，样品前处理简单，可用于上述3种维生素的快速分析。
关键词：超临界流体色谱；核黄素；烟酸；烟酰胺；维生素制剂
水溶性维生素对人们的生长发育和健康有着重要作用。人们除了从水果和蔬菜中摄取外，还从添加了维生素的食品和复合维生素制剂中补充人体的需要，因此有必要建立快速、稳定的分析方法用于其含量的测定。对维生素制剂中维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸)和烟酰胺测定的方法主要是高效液相色谱法。采用该方法虽可取得较好的结果，但其分析时间长，样品前处理麻烦。毛细管电泳、胶束电动毛细管电泳等方法也可用于其含量测定。本文建立了用超临界流体色谱同时测定这3种维生素的方法，该方法样品前处理简单、分析时间短、分离好，结果令人满意。
1 实验部分
1．1 仪器与试药
超临界流体色谱仪：Gilson Model SF3系统(英国)。核黄素和烟酰胺对照品购自Lancaster化学公司(英国)，烟酸购自Acros公司(英国)，甲醇为高效液相色谱纯，二乙胺为分析纯，CO2为超临界流体色谱纯。
1．2 色谱条件
色谱柱：Cyano(5μm，4.6mm i．d．×250mm，英国)；柱温：50℃；紫外检测器配有高压检测池，其检测波长为268nm；进样装置：带有10μL进样阀的自动进样器；流动相操作压力：20MPa。
2 结果与讨论
2．1 流动相组成对分离的影响
只用CO2或者CO2加甲醇作流动相时，这3种维生素不能完全分开；当在甲醇中加入少量二乙胺后，其分离情况得到大大改善。表给出了当流动相的流速一定，在CO2中分别添加10％和15％(均为体积分数)的甲醇，并在这两种体积分数下的甲醇中各分别添加0.1％和0.5％(均为体积分数)的二乙胺时上述3种维生素的保留时间，可见流动相中甲醇和二乙胺的含量对保留时间的影响很大。本文将l5％的甲醇(含有0.1％的二乙胺)添加到CO2中作流动相，可使3种维生素的同时分析在短时间内完成，分离结果令人满意。
2．2 流动相流速对分离的影响
当流动相组成为CO2加l5％的甲醇(含有0.1％的二乙胺)时，将流动相流速从2.0 mL/·min提高到3.0 mL/min，对这3种维生素的色谱峰形和分离情况都没有太大的影响，最后出峰的维生素B2的保留时间仅从5.11min降为3.37min。本文采用2.5mL/min的流速进行分析。

2．3 线性关系考察
将3种维生素对照品各取适量，精密称定后用甲醇稀释成含核黄素3～30mg／L、烟酸和烟酰胺各5～50mg／L的混合标准溶液。取6个不同浓度的对照品溶液按上述实验条件各进样3次，记录其色谱图；以对照品质量浓度X(mg／L)为横坐标，对应的峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程。可见上述3种维生素在适用浓度范围内具有良好的线性关系。
2．4 精密度及稳定性试验
通过测定上述3种维生素的日内和日间的峰面积，考察分析方法的精密度和样品的稳定性。在上述实验条件下，连续进样8次，核黄素、烟酸和烟酰胺峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.11％，0.85％和0.88％；放置1d后测定其峰面积的RSD分别为1.11％，0.60％和0.71％。精密度和稳定性均令人较为满意。
2．5 回收率试验
精密称取已知含量的同一样品3份，分别加入不同量的3种维生素对照品，按“2．6”节样品测定项下的实验步骤进样分析，计算其回收率。结果核黄素、烟酸和烟酰胺的回收率(平均值±SD)分别为：(97.3±1.34)％，(102.3± 1.25)％和(98.0±1.36)％。
2．6 样品测定
取昆明振华制药厂生产的复合维生素B(批号990701)5片，碾碎后用5mL甲醇溶解并超声提取20min，用0.45μm滤膜过滤，适当稀释后在上述色谱条件下进样分析。
2．7 讨论
(1)由于烟酸和烟酰胺的化学结构及性质相近，因此当以CO2加甲醇作流动相时，这两种维生素难以完全分开，且维生素B2的保留时间太长；若在流动相中加入0.1％的二乙胺，这3种维生素可以完全分开，且保留时间缩短，能够满足快速分析的要求。通过调节甲醇和二乙胺的体积分数，可使色谱峰形得到改善。
(2)分别以水、甲醇和乙醇作溶剂提取样品，结果以甲醇溶剂提取效果最好。样品用甲醇溶解并超声提取后，直接进样分析，不需要复杂的前处理。
(3)通过测定回收率、精密度并考察线性关系，表明该方法可以用于同时测定这3种维生素，结果令人满意。
参考文献：
[1] Hurtado S A，Nogues M T V，Pulido M I，Font A M．J Chrormatogr A，1997，778：247

仪器资料 · 发表于 2017-6-26 10:24:32

超临界流体色谱分析番茄红素
来源: 作者:齐国鹏,赵锁奇
摘要：以超临界C02作为流动相，在压力15.0～20.0MPa，温度25～50％，携带剂乙醇或正己烷的浓度分别为0～30％和0～20％的范围内考察了番茄红素及其氧化产物在C18色谱柱上的保留值的变化规律，确定了最佳的分离条件。对超临界丙烷萃取的番茄红素原料、萃取产物及萃余物进行了定量分析，考察了重复性及平行性。结果表明：在优化条件下，番茄红索的保留时间在3min以内，定量结果的重复性与平行性好。
关键词：超临界流体色谱，番茄红素
1 引言
番茄红素属于类胡萝卜素的一种，广泛分布于番茄、西瓜、葡萄等各种植物体中，作为多烯芳香烃，番茄红素是很强的抗氧化剂，可以消除血管中的自由基，淬灭单线态氧，对于抑制癌症有一定的效果。近年来，对番茄红素的分析方法的研究也日益增多。常用的方法是HPLC、TLC和紫外分光光度法等。这些方法各有特点，HPLC准确度较高，但有机溶剂耗费多；TLC设备要求不高，但分析时间长、精密度差；紫外分光光度法比较简单，但由于p．胡萝卜素等的干扰，容易产生较大的误差。
利用超临界流体色谱分析胡萝卜素已有报道，LesellierE列和Aubert 利用超临界流体色谱对α-胡萝卜素和β-胡萝卜素进行了分析。但采用超临界流体色谱专门分析番茄红素还未见报道。超临界流体具有高的扩散性和较强的溶解能力，有机溶剂用量少，操作温度低等优点，本文通过考察色谱柱温度、超临界流体的压力、超临界流体的组成及携带剂浓度等因素对番茄红素分离的影响，为研究番茄红素建立一种有力的分析分离方法。
2 实验部分
2．1 仪器与试剂
本实验室自行组装的超临界流体色谱仪，包括：两台ISCO 260DM 型注射泵输送二氧化碳，一台ISCO100DM型注射泵输送携带剂，三台泵由一台控制器控制，可以准确控制柱前压和携带剂的流量；冷冻机(重庆四达实验仪器厂)冷冻二氧化碳到一6℃；恒温箱(海安石油仪器厂)；TSP-100高压UV-VIS检测器(美国TSP公司)；Rhendyne 7125形六通进样阀配20μL定量管等部分。
二氧化碳(北京氦普北分气体工业有限公司，纯度99.99％)；无水乙醇(北京化工厂，分析纯)；正己烷(北京化工厂，分析纯)。
2．2 样品及处理
样品包括：番茄红素标准品，β-胡萝卜素，室温下放置半个月后的氧化的番茄红素标准品，加入β-胡萝卜素的氧化番茄红素标准品；超临界丙烷萃取番茄产品，萃取的番茄原料，萃余物。将上述样品分别称取适量溶于正己烷中。
2．3 色谱条件
Spherisorb Ctg色谱柱(中国科学院大连化学物理研究所，尺寸：250mm×4.5mm，10μm填料)；流动相为二氧化碳-乙醇，二氧化碳-正己烷；检测波长：472nm；进样量：20μL；温度、压力、流动相流速及组成以下说明。
3 结果与讨论
3．1 番茄红素的定性分析
本实验所用的番茄红素的样品为超临界丙烷萃取番茄产品，其中主要的杂质为β-胡萝卜素，同时由于番茄红素易于氧化，所以对番茄红素、番茄红素氧化物、胡萝卜素进行了定性分析。在相同的色谱条件下，分别注入番茄红素标准液、氧化后的番茄红素标准溶液、加入β-胡萝卜素的番茄红素标准溶液。结果如图可看出，番茄红素及其氧化物，β-胡萝卜素的保留时间随极性的减小而增加。
3．2 最佳条件的确定
为了保证番茄红素的定量准确，通过考察压力、温度、流动相组成及浓度对番茄红素与其氧化物分离的影响，确定了番茄红素分离的最佳条件。
3．2．1 柱前压的影响改变柱前压，当柱前压由17.0MPa增加到20.0MPa时，番茄红素及其氧化物的容量因子逐渐减少，两者的保留时间都缩短，但番茄红素与其氧化物可以实现分离。
3．2．2 柱后压的影响当柱前压、温度及携带剂流速不变，将柱后压由15MPa增加到19MPa，番茄红素与其氧化物的容量因子均减小，但番茄红素与其氧化物的相对保留值随柱后压的增加而减小，分离度也有减小的趋势。
3．2．3 温度的影响容量因子随温度增加的变化趋势如图看出，随温度升高，番茄红素与其氧化物的容量因子降低。番茄红素与其氧化物的相对保留值在室温时最大。由图也可看出，分析温度较低时，番茄红素与其氧化物的保留时间较长，但分离度较大，所以，分离的温度可选择室温。
3．2．4 携带剂的影响当乙醇浓度由5％增加到8％时，番茄红素容量因子减小很快，当浓度增大到16％时，番茄红素与其氧化物的相对保留值减小，乙醇合适的浓度为8％～10％。
若以正己烷做携带剂，变化趋势与乙醇相同，番茄红素与其氧化物的相对保留值与乙醇作为携带剂时的值相差不大，大约1.2。但在相同的浓度下，正己烷做携带剂分离番茄红素的容量因子比乙醇小。
3．3 番茄红素的定量分析
3．3．1 绘制番茄红素的标准工作曲线配制一系列浓度的番茄红素标准溶液，分别取20μL的上述标准溶液进色谱，并根据浓度．峰面积作标准曲线，标准曲线方程为Y =一0.049+7.42×0.0000001X(Y的单位为g／L)，拟合度为0.9990，线性关系较好。线性范围：3～240mg／L。
3．3．2 超临界萃取番茄红素样品色谱图选好适当的色谱分离条件，取20μL番茄红素产品的正己烷溶液进色谱，将产品中番茄红素的峰面积代入标准曲线，即可求出溶液中番茄红素的浓度，并求出产品中的番茄红素含量。
3．3．3 精密度及平行性测定分别称取适量的同一批番茄产品、原料、萃余物各2份，溶于10mL的正己烷中。取各份上述溶液平行测定4次，结果列入表可以看出，测量结果的相对标准偏差均在6％以内，具有良好的精密度，且结果的平行性也很好。
结合含量及总量进行物料恒算可以看出，原料中的番茄红素总量与产品及萃余物中番茄红素的总量较吻合，得到的结果可靠、准确。
4 结论
(1)使用超临界流体色谱，在C18色谱柱上定性分析番茄红素，可通过改变温度、压力、携带剂浓度来改善分离条件。本研究确定的优化条件为柱前压20.0 MPa，柱压降在3.0～4.0MPa，分离的温度选择室温，携带剂浓度在8％～10％。番茄红素的保留时间大约3min，分析时间短于HPLC。(2)超临界流体色谱定量番茄红素，相对标准偏差在6％以内，结果的重复性和平行性较好。
References
1 Cheng Jian(成坚)，Zeng Qingxiao(曾庆孝)．Food and Fermentation lndustr／ez(食品与发酵工业)，1999，26(2)：75～78
2 Wang Qiang(王强)，Han Yashan(韩雅珊)，Dai Yunqing(戴蕴青)．Chinese J．Chromatogr．(色谱)，1997，15(6)：534～535

仪器资料 · 发表于 2017-6-26 10:26:06

超临界流体色谱快速测定烟酰胺的含量
来源: 作者:郭亚东，马银海，张艳，彭永芳
摘要：采用超临界流体色谱快速测定制剂中烟酰胺的含量．在CO2流动相中添加10％的甲醇，于填充柱上分离，检测波长为216nm，在测定范围内，浓度与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.9998)，峰面积的相对平均偏差(RSD)为1.39％，平均回收率97.3％～101.3％，4min即可完成分析．方法简便，样品前处理简单，可用于制剂中烟酰胺的快速分析。
关键词：烟酰胺；超临界流体色谱；含量测定
水溶性维生素对人们的生长发育和健康有着重要作用，人们除了从水果和蔬菜中摄取外，还从添加了维生素的食品和复合维生素制剂中补充人体的需要，有必要建立快速，稳定的分析方法用于其含量测定。对烟酰胺的含量测定方法主要是高效液相色谱法，该方法取得了较好的结果，但其分析时间长，样品前处理麻烦。此外，毛细管电泳，胶束电动毛细管电泳，气／质联用等方法也用于它的含量测定．本文探索了用超临界流体色谱测定维生素含量的方法，结果令人满意。
1 仪器与试药
超临界流体色谱仪：Gihon Model SF3系统(英国)，对照品烟酰胺购自Lancaster化学公司(英国)，甲醇为高效液相色谱纯，CO2为超临界流体色谱纯．
2 实验方法及结果分析
2．1 色谱条件
色谱柱cyano(5μm，4.6×250mm)，柱温50℃，紫外检测器配有高压检测池，其检测波长为216nm，进样装置带有l0μL进样阀的自动进样器，流动相压力20MPa，流动相流速为2.0mL/min。
2．2 流动相对分离的影响
只用CO2作流动相时，其保留时间太长，且色谱峰拖尾严重；当在流动相中加人10％的甲醇后，其峰形大为改善，保留时间缩短；当流动相流速改变时，保留时间会有小的改变，但对峰形几乎没有影响。
2．3 线性关系考查
将烟酰胺对照品取适量，精称后用甲醇稀释成5～50μg/mL的标准溶液，取6个不同浓度的对照品溶液按上述实验条件各进样三次，记录其色谱图，以对照品浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=一351.6+147.7X，R=0.9998，可见在所用浓度范围内具有良好的线性关系。
2．4 精密度及稳定性试验
测定该维生素日内和日间的峰面积，以考查分析方法的精密度和样品的稳定性，在上述实验条件下，连续进样8次，烟酰胺峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.11％，放置1d后的RSD为1.39％，表现出良好的精密度和稳定性。
2．5 回收率试验
精密称取已知含量的同一样品三份，加人不同量的烟酰胺对照品，按样品测定项下的条件进样分析，计算其回收率，烟酰胺的回收率平均值±SD为98.3±1.28％。
2．6 样品测定
取昆明振华制药厂生产的复合维生素B(批号990701)5片，碾碎后用5mL甲醇溶解并超声提取20min，用0.45μm滤膜过滤，适当稀释后在上述色谱条件下进样分析，以峰面积按标准曲线法计算含量。
3 讨论
3.1 流动相选择
当用CO2加10%甲醇作流动相时，烟酰胺的保留时间为3.7min。可以满足快速分析的要求，且色谱峰形得到改善。
3.2 提取溶剂的选择
比较了水、甲醇和乙醇作溶剂提取样品，结果以甲醇较好。样品用甲醇溶解并超声提取后，直接进样分析，不需要复杂的前处理．
3．3 结果
通过测定回收率，精密度并考查其线性关系，表明该方法可以于快速测定烟酰胺含量，能给出满意的结果．
[参考文献]
[1] Hurtado S A，Nogues M T V，Pulido M I et a1．Determination of water—soluble vitamins in infant milk by HPLC[J]．chromato A，1997，778：247．
[2] Wills R B H，Shaw C G，Day W R．Analysis of water soluble vitamins by PHLC[J]．Chromatogr Sci．，1977，15：62．

仪器资料 · 发表于 2017-6-28 08:36:03

确实是难得好帖啊，讓我涕流滿面，頂頂一起下吧先

仪器资料 · 发表于 2017-7-1 08:52:34

這個資源非常需要，支持一起下吧！

仪器资料 · 发表于 2017-7-4 02:30:44

额，為神馬現在才發現一起下吧的資源啊~@_@

仪器资料 · 发表于 2017-7-11 23:01:01

确实是难得好帖啊，讓我涕流滿面，頂頂一起下吧先

超临界流体色谱法的几个应用合集

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