基础知识讲座之：HPLC-MS的应用

仪器资料 · 发表于 2018-6-25 10:34:36

基础知识讲座之：HPLC-MS的应用

HPLC/MS的应用（1）

目前HPLC/MS的应用主要集中到三个领域：（1）新药开发研究、制药和医药研究: (2) 环境科学;和（3）生物技术。其中开发新药的研究是HPLC/MS的主要推动力[1]。

一、 HPLC/MS在新药开发中的应用

HPLC/MS在新药开发的各个阶段都有所应用，在这一领域的应用关键是有三方面的需求：（1）灵敏度要高; （2）选择性要好;（3）分析速度要快。LC/MS与UV和二极阵列检测器比较，LC/MS兼有鉴定功能和灵敏度高的特点，而且LC/MS有易于操作和自动化的优点，所以它成为新药开发十分有用的工具。

在新药开发中无论是使用一般的“智能”合成方法或是使用组合化学的方法，都可以使用为开发新药可用的LC/MS软件，许多公司可以提供这样一来的软件[1]。

第一个广泛使用的工具是"Open Access", 它为合成化学家把API-MS转换为可直接获得信息的“黑匣子”，即通过其产物分子的质谱测定来快速确证其合成路线是否正确。把远程计算机接到该系统里，在输入样品鉴定码和要进行的LC/MS实验后，计算机告诉你可以使用的自动进样器台架，样品注入后自动进行分析，也就是说以正离子和负离子两种模式进行分析，并在高和低的离子源CID电压下运行，得到的质谱图通过LIMS（实验室信息管理系统）传送到实验人员手中，也可以用电子邮件方式传送到实验人员手中。

目前更多地使用组合化学的方法进行新药的合成，组合数据库需要进行生物活性筛选，同时也需要对产物进行快速的鉴定和表征，而LC/MS是完成后一程序的手段。在分析系统里包括一个x-y自动进样器，可以从96 个样品位的取样盘中进样，与旁路-色谱柱的API-MS或快速LC-MS相连接，这里常使用单级四极杆，但是现在使用oa-TOF仪器的在不断增加，因为准确测定质量会有利于定性分析的确证。这一软件可以对大量样品进行快速的检测，例如在旁路-色谱柱的模式下每小时可以分析60个样品。如果和UV-PDAHPLC检测器同时在线使用，还可以对产物的纯度进行检测]。也有把生物活性筛选和质谱表征结合在一起的[5]。

另外一个工具是把组合化学数据库快速筛选，或者从坦然产物中选拔出来的组分和制备级纯化结合在一起的方法，这里使用了制备型色谱柱。

在Open access 和组合化学的策略中结构确认是很重要的，整个分子的质谱是结构确认的基础，在新药开发中这一工作是十分繁杂和耗费经理的，包括杂质的筛选、鉴定，药物代谢产物的鉴定，药的降解产物研究，和药的处方等。这些工作就需要使用MS/MS方法。对这一类研究常需要准确地测定质量数，在这一工作中常使用FT-ICR-MS和Q-TOF质谱仪。另外一个有意义的动向是使用在线LC和nano-ESI连接使用，并利用离子阱质谱进行微量物质的MS/MS检测[50]。另外一个研究动向是把LC/MS和LC/NMR在线结合在一起使用。

[1] 现代液相色谱-质谱技术（State-of-the-art liquid chromatography-mass spectrometry ），W. M. .A. Niessen , J. Chromatogr.,1999,856: 179-197

发表于 2018-6-25 10:34:58

HPLC/MS的应用（2）

二、HPLC/MS在临床药物分析中的应用

在药物分析中另外一个重要领域是临床使用前和临床使用的药物测试，以及要药动学和药代学研究的分析，这就需要LC/MS的自动和无人管理的LC/MS仪器。快速和常规的LC/MS分析需要快速和自动的样品处理以及数据处理软件[1]。
用LC/MS进行定量分析的关键是：
（1）可以检测pg甚至低于pg量以下的被测样品;
(2)    在大量生物样品中有高的选择性，特别是在运行SRM（选择性反应监测）模式时犹为重要;
(3)    对被测化合物确认有高的可信度;
(4)    要能使用理想的同位素标记内标。
LC/MS/MS和LC/UV/PDA一样易于操作，但是LC/MS/MS具有更好的选择性。所以LC/MS/MS成为制药工业定量分析首选的方法。但是很遗憾在公开发表的文献中没有很多十分成功的LC/MS用例。
在生物定量分析中的一个极其严重的问题是样品本底的干扰，特别是ESI的情况下，常常由于样品中未知本底的干扰，使信号被压抑，改善样品的处理方法可以比较好地解决这一问题。但是在有些情况下可以使用APCI也是一种解决的途径。
近几年用HPLC/MS和HPLC/MS/MS对各种药物及其代谢产物的研究有大量的文献报道。

发表于 2018-6-25 10:35:23

HPLC/MS的应用（3）

三、HPLC/MS在环境科学和生物医学中的应用

HPLC/MS在环境科学中有很多的应用[82]，在这一领域的应用不同与在药物分析中的应用。在医药领域的分析常常是只需要分析某一个或某几个特定的对象，使用SRM模式可以增加它的确认和选择性。而在环境分析中常要从各种化合物筛选出一批为数不多见的或某些类要优先控制的物质，由于从管理的角度出发，一般有较宽的筛选范围。这样就给环境分析带来麻烦。例如一般要求在饮用水中的任何一种农药的含量要低于0.1μg/L，在对这样低含量的农药进行定性和定量分析，就必须进行浓缩（如液-液萃取或固相萃取）并结合选择性离子检测或SRM，但是这一方法不是全面筛选。当含量低时就取较大容积的样品，因而就要进行预浓缩，这样不仅把要分析的组分浓缩，也必然把干扰物浓缩，于是就妨碍分析的全程扫描。在用ESI和APCI进行分析时具有十分不同的响应值，例如有些物质可以用正离子模式进行检测，而另外一些物质只能在负离子模式进行分析。如果要进行SRM操作，需要针对每种具体的化合物类型所使用的离子源、碰撞室操作参数进行优化。这一问题在不仅对农药的环境分析是如此，其它的环境污染物如表面活化剂、甚至药物残留]等也需要考虑。
在环境分析中一个典型的分析方法叫做SAMOS，这一方法可以在无人管理的情况下进行自动分析，取100mL的地表水，用一个萃取小柱子自动进行在线固相萃取，然后进行HPLC的梯度洗脱，用UV-PDA检测。可以用UV对有紫外吸收的化合物进行定量分析，也可以利用UV光谱数据库，对未知化合物或化合物类别做定性检测。但是对对未知化合物或化合物类别的确认必须要使用MS，常常要使用HPLC/MS或HPLC/MS/MS进行。
近来，把取样量由100mL降低到10mL，这样一来可以改善HPLC/MS的性能。另一方面，使用oaTOF可以对地表水进行中的农药进行定性和定量分析。
在近来的文献中有许多研究报告讨论各种环境污染的LC/MS分析方法。

发表于 2018-6-25 10:35:51

HPLC/MS在生物医学中的应用

ESI常常用于肽和蛋白质表征的各个阶段：分子质量的测定; 氨基酸的测序; 蛋白质的化学和后-转移修饰位置和性能的测定; 蛋白质第三和第四级形态的研究和非共价键结合的研究。在大多数情况下不一定需要联机检测，但是如果样品溶液通过ESI或nano-ESI进入质谱系统，那就会得到更为完善的结果。用LC/ESI/MS测定在人（凝血）因子VIII重组体N-糖基化位点是这一领域应用的例证。也有人用LC/MS结合微柱切换技术鉴定主要组织相容性复杂分子类别I中有肽的存在。用LC/MS结合研究寡糖、寡核苷酸、核酸等有许多研究报告
nanoHPLC/nanoESI-MS联用进行蛋白质组学的研究
文章报道了一种高效（峰容量为~103）纳米级（使用内径为 15 μm 的毛细管色谱柱）的高效液相色谱(nanoLC) 和小流量的电喷雾 (nanoESI) 质谱联用的仪器，使用这一仪器进行了球蛋白酶的消化液（即蛋白质组学的研究）复杂体系的分析。
选择适当的溶剂用液体匀浆法填充 87-cm 长、柱内径为 14.9~74.5 μm的色谱柱，所用填料的直径为 3 μm 的 C18 键合在多孔（ 30 nm 孔径）硅胶上的固定相，使用的压力为 18 000 psi.。流动相的压力为 10 000 psi ，流速为20 nL/min，LC 的线流速为 0.2 cm/s ，这一流速接进于系统的最佳分离效率的流速。
为了保持色谱系统的柱效，要把连接到 nanoESI 喷口（其直径只有 2~10 μm，具体大小决定于填充毛细管色谱柱的直径）上的连接管的直径要小到10 μm），通过 nanoESI 接口把混合四极杆飞行时间质谱和高效液相色谱仪连接起来。当把切换阀连接到 nanoESI 阳极进样做定量分析时，Nano LC 能把蛋白质水解出来的多肽混合物进行分离，其峰容量为 103。在样品量范围较大时（例如：5~100 ng ，球蛋白水解肽的量为50~500 ng 时，分别使用14.9- 和 29.7-μ m-i.d 的填充毛细管色谱柱），nanoLC/nano ESI MS 对低丰度复杂混合物组份的响应值是随样品量的增加而呈线性地增加，nanoLC/nanoESI MS 在 20-400 nL/min 流量的范围内，其灵敏度是随柱流量的减小呈线性地提高，或者大约随毛细管色谱柱内径的平方成反比关系。这样，除去在低负荷的情况下，减小分离毛细管色谱柱的内径和增加进样量的效果是一样的，这一情况对受样品量限制的蛋白质组学的应用是很重要的。
使用表面孔径为 300-Å 多孔 C18 填料相对于使用无孔填料，对多肽的回收率没有太大的影响。
也进行了使用高效 nanoLC 进行串联质谱的分析，实验证明是可行的。
在一支色谱柱上（用单一的 nanoESI 喷嘴）对色谱的流出时间、MS 的相应值和质谱测定的准确性进行了考察。对复杂的蛋白质组学样品使用不同的色谱柱（相同和不同的毛细管色谱柱内径连接不同的 nanoESI 喷嘴）以及不同的样品（不同的球蛋白水解液浓度）进行了研究，结果证明这一方法的耐用性和重复性和灵敏度都很好。

发表于 2018-6-25 10:36:08

nanoHPLC/nanoESI-MS联用进行蛋白质组学的研究
文章报道了一种高效（峰容量为~103）纳米级（使用内径为 15 μm 的毛细管色谱柱）的高效液相色谱(nanoLC) 和小流量的电喷雾 (nanoESI) 质谱联用的仪器，使用这一仪器进行了球蛋白酶的消化液（即蛋白质组学的研究）复杂体系的分析。
选择适当的溶剂用液体匀浆法填充 87-cm 长、柱内径为 14.9~74.5 μm的色谱柱，所用填料的直径为 3 μm 的 C18 键合在多孔（ 30 nm 孔径）硅胶上的固定相，使用的压力为 18 000 psi.。流动相的压力为 10 000 psi ，流速为20 nL/min，LC 的线流速为 0.2 cm/s ，这一流速接进于系统的最佳分离效率的流速。
为了保持色谱系统的柱效，要把连接到 nanoESI 喷口（其直径只有 2~10 μm，具体大小决定于填充毛细管色谱柱的直径）上的连接管的直径要小到10 μm），通过 nanoESI 接口把混合四极杆飞行时间质谱和高效液相色谱仪连接起来。当把切换阀连接到 nanoESI 阳极进样做定量分析时，Nano LC 能把蛋白质水解出来的多肽混合物进行分离，其峰容量为 103。在样品量范围较大时（例如：5~100 ng ，球蛋白水解肽的量为50~500 ng 时，分别使用14.9- 和 29.7-μ m-i.d 的填充毛细管色谱柱），nanoLC/nano ESI MS 对低丰度复杂混合物组份的响应值是随样品量的增加而呈线性地增加，nanoLC/nanoESI MS 在 20-400 nL/min 流量的范围内，其灵敏度是随柱流量的减小呈线性地提高，或者大约随毛细管色谱柱内径的平方成反比关系。这样，除去在低负荷的情况下，减小分离毛细管色谱柱的内径和增加进样量的效果是一样的，这一情况对受样品量限制的蛋白质组学的应用是很重要的。
使用表面孔径为 300-Å 多孔 C18 填料相对于使用无孔填料，对多肽的回收率没有太大的影响。
也进行了使用高效 nanoLC 进行串联质谱的分析，实验证明是可行的。
在一支色谱柱上（用单一的 nanoESI 喷嘴）对色谱的流出时间、MS 的相应值和质谱测定的准确性进行了考察。对复杂的蛋白质组学样品使用不同的色谱柱（相同和不同的毛细管色谱柱内径连接不同的 nanoESI 喷嘴）以及不同的样品（不同的球蛋白水解液浓度）进行了研究，结果证明这一方法的耐用性和重复性和灵敏度都很好。