双向电泳简易中文操作手册

仪器资料 · 发表于 2017-8-19 15:46:25

双向电泳简易中文操作手册

第一章样品制备 2
1.1 一般性原则 2
1.2 样品制备程序 3
1.2.1 培养细胞样品处理方法 3
1.2.2 组织样品处理方法 3
1.2.3 文献报道较多的裂解液配方 4
第二章第一向等电聚焦（IEF） 7
2.1 IPG胶条的水化和电泳 7
2.1.1 仪器 7
2.1.2 试剂 7
2.1.3 实验步骤 7
2.2 IPG 胶条的平衡 9
2.2.1 仪器 10
2.2.2 试剂 10
2.2.3 实验步骤 10
第三章第二向 SDS 电泳 12
3.1 垂直SDS-PAGE 12
3.1.1 溶液 12
3.1.2 灌胶步骤 12
3.1.3 电泳步骤 14
第四章 2-DE胶蛋白质点的检测 15
4.1 考马斯亮兰染色 15
4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序 15
4.1.2 Neuhoff 胶体考染法 15
4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法 16
4.2 硝酸银染色 16

样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影
响2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多
样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽
提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）
破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状
态。
根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),
主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），
也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年
较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂
（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓
糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入
Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor
cocktails ）以及核酸酶。
样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理
组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必
须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、
多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过
高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这样都会造成2-DE 的
失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防
止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。脂类和多
糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以
采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。
因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要
求来进行选择。

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