HPLC专家解答精华集

仪器资料 · 发表于 2017-8-28 21:18:03

HPLC专家解答精华集

biosepq 问：反相C8基线问题。
我使用的是Agilent Zorbax C8柱（4.6x150mm），想在1100上进行一个蛋白的分析。样品是自己纯化的，SDS-PAGE纯度为90%以上，总蛋白浓度1mg/ml。
流动相为：0.1% TFA in water　　0.1% TFA in ACN
梯度：5~95%B, 50min；100% B 10min
（water为18.2M欧，ACN为 J T baker,HPLC级，1100带自动在线脱气，自动进样器）
进了两次样，第一次50vl，第二次100vl。

然后进空白样（water），发现基线不稳，而且在固定的B浓度处会有峰洗出。重复进空白样也是如此，杂峰的位置和面积几乎没有变化，重复性很好。开始怀疑是流动相的问题，换为新鲜超纯水和新的ACN，不加TFA，平衡柱子后，重复作上述线性梯度，依然有大量杂峰。
用100% ACN洗柱 1hr，基线可以走得很平；5% B平衡，也可以走平
但重复走梯度，仍然基线在50~90%处有大量杂峰（如图）。
整个过程中，未见有明显压力增加。
请问，这是什么缘故阿？到底是什么东西一直出峰阿，是不是有蛋白沉淀在柱头了呢？谢谢了

你用100% ACN洗柱 1hr，基线可以走得很平；5% B平衡，也可以走平，这是因为你不是走梯度，不存在柱平衡问题。走梯度，基线自然相对不稳。请你
把走梯度测样品的色谱图附上给我，一看究竟，作对比。匆此。后谈。

yjyanjun wrote:
专家：
您好！
我现在在做一个有机盐的药代动力学，卡在HPLC色谱条件上。我采用了梯度洗脱的方法，血清去蛋白后直接进样检测该药物，有一杂峰干扰。我曾经得到了比较好的分离结果，可是去无法重复。而且该药的峰比较宽，是不是由于不纯所致？
另外，由于该化合物在酸性和中性环境下容易转化为其代谢产物，所以我们碱化流动相，化合物的峰变得锐利，可是这是以牺牲柱子的寿命为代价的，效果并不理想。
请问，对于这种极不稳定的盐，我还有什么高招？我可不可以考虑使用耐碱的柱子并且前面加上饱和柱，可是这样就一定能解决问题吗？请您指正，谢谢！
HPLC专家解答：
不知该有机盐什么结构或名称，难于对症下药。
请你发“三有”或“五有”电邮给我后，我认真分析后再作答复
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