基础知识普及之：HPLC的主要分离方法

仪器资料 · 发表于 2018-6-25 10:37:33

基础知识普及之：HPLC的主要分离方法

1.液相色谱的分类

一、按分离过程的物理化学原理分类

吸附色谱(Adsorption Chromatography)：用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，样品中各组分依据它们在吸附剂上吸附力的大小来进行分离的色谱方法。

分配色谱（PartitionChromatography）：用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，样品中各组分依据它们在固定液中溶解能力大小，即在固定相和流动相间的分配系数大小来进行分离的色谱方法。

离子交换色谱（Ion ExchangerChromatography）：用离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中各离子组分依据它们与离子交换剂上荷电交换基团的交换能力大小来进行分离的色谱方法。

空间排阻色谱（Size ExclusionChromatography）：用化学惰性多孔物质作固定相，样品中各组分依据它们在流动相的分子体积大小来进行分离的色谱方法。以水溶液作流动相的排阻色谱称为凝胶过滤色谱（Gel FitrationChromatography）；以有机溶剂作流动相的排阻色谱称为凝胶渗透色谱（Gel PermeationChromatography）。

亲合色谱（AffinityChromatography）：用固相基体上固载化生物特异性吸附的配位体作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中各生物活性分子组分依据它们与固相基体上固载的配位体之间的特异亲合力大小来进行分离的色谱方法。

二、按实际应用色谱类型分类

· 正相高效液相色谱

· 反相高效液相色谱

· 离子对色谱

· 离子交换色谱和离子色谱

· 空间排阻色谱

· 疏水作用色谱

· 手性色谱

· 电色谱等

HPLC的主要分离方法-2.正相色谱与反相色谱

根据固定相和流动相的相对极性大小，高效液相色谱分为：

· [url=]正相色谱（Normal PhaseChromatography）：[/url]

固定相的极性大于流动相的极性，包括使用极性吸附剂的液固色谱、正相液液分配色谱、正相键合相色谱。

· [url=]反相色谱（Reversed PhaseChromatography）:[/url]

固定相的极性小于流动相的极性时称为反相色谱，包括使用非极性吸附剂的液固色谱、反相液液分配色谱、反相键合相色谱。

一、正相色谱

采用硅胶、氧化铝或带有氰基、二醇基和氨基的极性固定相，非极性流动相操作模式，依据溶质分子的极性大小进行分离。溶质分子与固定相的极性基团产生特异的极性相互作用，极性作用大小决定的保留时间大小。
正相色谱经常采用的色谱柱的柱强度：
硅胶柱 ≈ 氧化铝柱 > 氨基柱 > 二醇基柱 > 氰基柱

二、反相色谱

采用非极性表面的疏水载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂系统为流动相的操作模式，依据溶质分子的疏水性大小进行分离。溶质分子疏水基与疏水固定相产生非特异的疏水相互作用，疏水作用大小决定的保留时间大小。
反相色谱柱的柱强度（疏水化合物在反相柱的保留值）：
碳十八柱 ≈ 碳八柱 > 苯基柱 > 碳四柱 > 碳三柱 > 碳一柱（TMS）> 氰基柱>> 非键合硅胶
反相色谱中常用含水乙腈、甲醇和四氢呋喃的流动相。

HPLC的主要分离方法-3.液固吸附色谱

液固色谱的分离基础是溶质分子和溶剂分子与固体吸附剂（固定相）表面活性点的竞争吸附，即溶质经过色谱柱时不断地重复进行吸附-解吸过程，由于溶质在吸附剂上的吸附作用的差异而获得分离。因此液固色谱又称为吸附色谱或液固吸附色谱。

液固吸附色谱适合于分离那些能溶于有机溶剂、具有不同类型的中等分子量的化合物, 如具有不同取代基, 或取代基数目不同的化合物。对于异构体的分离, 液固吸附色谱比其它液相色谱有更高的选择性。如反相色谱中双键位置不同的异构体不能理想分离时, 可选用硅胶吸附色谱分离。

1 液固色谱固定相（硅胶固定相）

硅胶在高效液相色谱应用广泛，是液固色谱的主要固定相和键合固定相的基体。

硅胶的色谱保留特性取决于硅胶的表面特征：游离型硅羟基、氢氧化硅羟基和硅氧桥结构。一般认为，硅氧桥结构吸附性很差，对色谱分离影响很有限，硅胶表面的活性吸附点主要是游离型硅羟基和氢氧化硅羟基，后者又有活泼型和束缚型之分。

2 液固吸附色谱保留机理

在液固吸附色谱中，溶质和固定相间存在两种特殊作用：

· 溶质和溶剂分子对吸附剂表面活性点的竞争作用，这使得溶剂组成变化会引起分离变化。

· 溶质官能团与吸附剂表面活性点的吸附受到官能团位置影响。因此，吸附色谱法比其他色谱法更适合于分离异构体。

[url=]顶替吸附模型 [/url]

Snyder等认为：在液固色谱中，硅胶表面被溶剂分子（S）覆盖形成一单分子层。当溶质分子(X)被流动相带入色谱柱时, 溶质分子便于与已吸附的溶剂分子对固定相达到活性吸附点进行竞争，顶替吸附剂表面上原来覆盖的溶剂分子而被吸附。溶质的保留值取决于在吸附剂活性表面上溶质分子与溶剂分子的竞争吸附以及溶质分子与溶剂分子间的作用。

3 溶质分子结构对保留值的影响

样品分子所含的官能团的类型及其数目的多少决定它们在吸附色谱柱上保留大小。一些常见官能团的吸附强度大致如下：
不吸附：烷烃
弱吸附：烯烃、硫醇、硫醚、单环或双环芳烃、卤代芳烃
中等吸附：多环芳烃、醚、腈、硝基化合物、大多数羰基化合物
强吸附：醇、酚、胺、酰胺、亚枫、酸和多官能团化合物

样品分子的保留能力还取决于分子空间效应, 即基团的空间位置与吸附能力有关。如：
与官能团相邻的庞大的烷基可能降低保留能力；
顺式化合物的保留能力可能比反式化合物强；
对位化合物的保留能力可能比邻位化合物强等等。

4 流动相组成对保留值的影响

在硅胶吸附色谱中, 对相对保留值和分离选择性起主导作用的是溶质与固定相的作用, 流动相主要是调节溶质的保留值在适当范围内, 对选择性的影响一般较小。

液固吸附色谱的流动相e°值要适当，常用正己烷、正庚烷为主, 添加少量CH2Cl2、CH3Cl、CH3CN和CH3OH。
　

5 液固吸附色谱应用

主要用于异构体的分离、族分离和制备色谱。
液固色谱的应用特点：
2 液固色谱对具有不同极性取代基的化合物或混合物表现出较高的选择性，但对同系物的分离能力较差
2 对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆吸附，液固色谱常不能获得满意的分离习惯。
吸附剂的含水量对吸附剂活性、样品容量和保留值有较大影响。

发表于 2018-6-25 10:38:02

HPLC的主要分离方法-4.反相键合相色谱

在高效液相色谱中，反相色谱是应用最广的一类分离模式，占到高效液相色谱的70~80%。这其中又以反相键合相色谱最为普遍。

反相键合相色谱的优缺点：
① 样品极性范围宽, 有多种键合相可供选择；
② 大部分使用的极性溶剂-水流动相，平衡速度快；
③ 可用离子对或离子抑制技术分析离子或可离解化合物；
④ 容易操作, 分析速度更快, 重现性更好。
但应注意，对于硅基键合相, 流动相的pH应在2.5~7.0之间。pH<2.5, 键合相易脱落；pH>7.5, 硅胶可能溶解。

1 反相键合相固定相与流动相

一、反相色谱柱类型

反相色谱柱类型包括：
a) 以硅胶为基质的反相柱（方框图展开，第二层）
i. 常规硅胶键合C18，C8等填料柱
ii. 对硅胶做碱性脱活的反相柱：适合分离碱性物质
iii. 高碳覆盖量的柱：具有较高的保留值
iv. 高稳定反相柱：可在较宽的pH范围内使用
b) 以聚合物为基质的反相柱：特点是化学稳定性好，pH范围宽，但刚性不如硅胶
苯乙烯-二乙烯苯共聚物l
l 高度交联的苯乙烯-二乙烯苯共聚物化学改性
聚丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、聚乙烯醇类、苯乙烯和甲基丙烯酸酯-二乙烯基苯的共聚物l
l 以其他氧化物为基质的反相柱：如二氧化钛和二氧化锆无机氧化物

二、反相色谱的流动相

反相色谱中常用洗脱剂包括水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等。流动相的洗脱强度由有机强度的浓度和类型共同决定，这种影响见反相色谱溶剂强度图。

2 反相键合相色谱

一、反相色谱的分离机理---疏溶剂理论（Solvophobic theory）

疏溶剂理论的主要意思是：当一个非极性溶质或分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时, 会相互产生斥力, 自由能(DG)增加, 这是一个熵减少过程。为了弥补熵的损失, 溶剂分子中的非极性部分的结构取向将导致在极性溶剂中形成一个“空腔”。这种效应称为疏溶剂效应。

二、影响溶质保留的因素讨论

①流动相的极性（lnk’ ∝ γ）：降低流动相的表面张力，组分的保留值变小。通常，溶剂的表面张力与极性成正比。
在反相色谱中，水的表面张力最大。减少流动相中水的比例，即有机溶剂比例增大, 流动相的极性增大，表面张力下降, 保留值变小。

反相色谱中常用洗脱剂包括水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等。关于溶质在反相色谱中的保留值与强溶剂浓度的关系，Snyder认为lgk与%B之间呈线性关系： lgk=lgkw-SØ

A项D② 烷基键合相链长（lnk’ ∝ AL ( )）（待链接一些色谱图）：实验表明，采用相同的流动相，溶质的保留值随着烷基键合相链长增加而增大。

③ 溶质的疏水特性（lnk’ ∝ AS A项)）：大量实验证实，溶质的疏水性越大，保留时间越长。非极性化合物分子（或化合物中的非极性部分）表面积越大，其疏水性越大，在反相色谱中的保留值也越大。如D(
● 烷基苯同系物：苯，甲苯、乙苯、丙苯、丁苯等同系物，随着烷基链增长，保留值依次增大。
● 苯系物：苯、萘、蒽等多环芳烃，环数增大，保留值依次增大。
此外，在反相色谱中离子化合物不被保留；对于非离子化合物，极性大，保留值值小；对于非极性部分相同的化合物，保留值随极性官能团增加而下降；对于几何异构体，能形成内氢键的异构体的化合物的保留值变大。　

三、反相高效液相色谱的应用

反相高效液相色谱的应用十分广泛，是HPLC中应用最为普遍的一种模式，从一般小分子有机物到药物、农药、氨基酸、低聚核甘酸、肽和分子量不大的蛋白质（小于50KD）。

HPLC的主要分离方法-5.离子对色谱

大多数可离解的化合物在液固色谱分离时，强烈的吸附在硅醇基上, 造成保留时间太大, 甚至不能流出色谱柱, 或者严重拖尾, 柱效很低。同样，离子型化合物在反相色谱中也难于保留。但是，采用离子抑制技术或离子对色谱方法可对它们进行分离分析。

一、离子抑制技术

在水溶液中，酸性化合物会离解。降低流动相的酸度，离解增大，造成保留降低；增大流动相的酸度，抑制弱酸离解，保留时间增大。调节流动相的pH大小，抑制离子离解，可使弱酸或弱碱的有机物在反相柱上得到较好的保留。
二、反相离子对色谱

1) 反相离子对色谱的优缺点

· 使用高效反相柱, 柱效比离子交换色谱高；

· 有更多条件改变分离度和选择性；

· 快速和动态柱平衡；

· 色谱体系更复杂, 需要添加离子对试剂等（缺点）。

2）反相离子对色谱的基本原理

流动相添加"离子对试剂"，使得难保留的样品离子与离子对试剂形成中性离子对缔合物，增加它们在反相柱上的保留能力。不同的样品离子, 形成离子对的能力不同，导致它们在色谱柱的保留时间不同。

可见，离子对的疏水性越强，保留值越大。离子对试剂浓度增加, 有利于疏水离子对的形成, 保留值也随之增加。

3) 影响保留的因素

· 离子对试剂
[url=]① 离子对试剂的选择：[/url]

阳离子样品选用烷基磺酸钠；阴离子样品选择季胺盐，如四丁基溴化胺等。

[url=]② 对离子烷基链：[/url]

增大烷基链, 离子对的保留时间增大, 但对分离的选择性影响不大；而采用短烷基链的对离子试剂, 适用于性质相似的样品离子分离。

[url=]③ 对离子的浓度：[/url]

在一定的浓度范围内, 其浓度增大, 保留时间也增大。但不应超过形成胶束的CMC。

· [url=]流动相：[/url]

由于CH3OH对许多离子对试剂有较好的溶解性, 一般采用CH3OH / H2O流动相。流动相应控制在适宜样品离子完全离解的pH值，缓冲浓度约为(1~5)mmol/L。

· [url=]键合相的烷基链长：[/url]

通常采用覆盖度较高的碳十八键合固定相。

· [url=]其它因素：[/url]

柱温的影响大于其它液相色谱分离模式; 其它副反应也可能影响分离效果。

四、应用

· 酸和碱混合物的分离

· 金属螯合物的分离

发表于 2018-6-25 10:38:18

HPLC的主要分离方法-6.离子色谱

离子色谱

1 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography，IEC)

离子交换色谱是一种以离子交换剂为固定相，用来分离分析阳离子和阴离子的液相色谱法，其分离原理是溶质离子和流动相中的抗衡离子间与离子交换剂上的固定离子点位的亲合竞争。
凡是在溶液中能够电离的物质，通常都能用离子交换色谱进行分离，它不仅适用于无机离子混合物的分离，也可用于有机物的分离，特别是氨基酸、核酸、蛋白质等生物物质的分析。

一、离子交换色谱固定相
高效离子交换色谱固定相通常是具有高机械强度和传质快的离子交换剂，一般在有机高聚物或硅胶上接枝有机季胺或磺酸基团交换基团。

· 聚合物多孔离子交换树脂

· 硅胶化学键合离子交换剂

· 表面薄壳型离子交换树脂

二、离子交换色谱的流动相
一般采用含盐的水溶液作为流动相，流动相选择应满足：

· 能够溶解各种盐并提供离子交换必需的缓冲液

· 具有合适的离子强度以便控制样品离子的保留值

· 对被分离的对象有选择性

三、离子交换色谱基本原理
在一定酸度下，样品离子和洗脱离子与离子交换基的相互作用决定离子交换色谱的保留值。
对于阳离子交换色谱，样品离子X+和流动相离子Y+与争夺离子交换剂上的交换中心R-；而对于阴离子交换色谱，样品离子X-和流动相离子Y-与争夺离子交换剂上的交换中心R+。与离子交换剂上交换中心作用力强的样品离子保留时间长，反之就短。
四、氨基酸分析仪

2 离子色谱

1975年Small发明了采用电导检测器检测离子交换色谱流出液方法。为有别于以往的离子交换色谱法，他把这一方法称为"离子色谱"。

[url=]课堂问题：为什么常规的离子交换色谱不能采用电导检测呢？[/url]

电导是离子的通用性质，其检测灵敏度液很高。但是离子交换色谱通常采用较高浓度的盐溶液作为洗脱剂，这样洗脱离子的电导大大超过样品离子的电导，换句话说，样品离子的电导被背景电导所淹没。因此，常规的离子交换色谱不能之间采用电导检测。

一、抑制型离子色谱

（1）抑制原理

阴离子分析采用低容量的强酸型阴离子交换柱分离柱, NaHCO3和Na2CO3混合液作流动相。采用高容量的强酸型阳离子交换柱作抑制柱, 串联在分析柱后面, 从分析柱的流出液经过抑制柱时发生抑制反应。

（2）抑制柱的类型

· 树脂填充柱

· 电化学抑制柱

二、非抑制离子色谱（单柱离子色谱法）
采用低容量的离子交换色谱柱分离，低电导低浓度的洗脱液，由于降低了洗出液本底电导水平，这样可采用电导检测器检测样品离子的电导。单柱法通常可在普通色谱仪上进行。
三、间接光度色谱法
间接光度法是一种离子对探针检测无紫外响应物质的技术。在离子色谱中，如果流动相含有吸收紫外光性能的洗脱离子，那么可以采用紫外检测器间接检测无紫外吸收的样品离子。