基础知识普及之：带你认识液相色谱

仪器资料 · 发表于 2018-6-25 10:39:56

基础知识普及之：带你认识液相色谱

HPLC简介-1.液相色谱的发展史

高效液相色谱是在20世纪60年代末期，在经典液体柱色谱的基础上, 引入GC的理论和技术, 并加以改进而发展起来的新型高效分离分析技术。在液相色谱的发展史上，有几个重大事件值得人们回忆。
l 1903年，色谱法问世
俄国植物学家茨维特（Tswett，1872-1919）从1901年起开始研究植物色素。1903年3月21日，他在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法（Chromatographie（德）；Chromatography（英））。1907年在德国生物学会年会上，展示过带有色带的分离柱管和纯化过的植物色素溶液。茨维特被世人公认为色谱的创始人。茨维特把菊根粉或百垩粉（CaCO3）装在玻璃管中，将植物叶子的石油醚提取液倒入管中，然后加入石油醚淋洗。随着淋洗进行，样品中各种色素向下移动的速度不同，逐渐形成一圈圈的连续色带。茨维特在当时的实验中观察到6个色带，它们分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A和B。茨维特工作的主要贡献：
▲（采用吸附色谱）成功分离了叶绿素a和叶绿素b
▲ 发明了伟大的色谱法
希腊语chroma（色彩）graphos（图谱）
德语Chromatographie
英语Chromatography
Chromatographic column
Statinary phase
Mobile phase or eluent
l 1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素后，色谱法引起科学界的重视
1931年，德国的Kuhn和Lederer采用类似Tswett的柱色谱方法，采用纤维状氧化铝和碳酸钙作吸附剂，把结晶状的胡萝卜素分离成α-和β-两种同分异构体，而且确定了它们的分子式。随后他们分别从植物叶片和蛋黄中分离得到叶黄素，才使色谱法引起科学界的重视。1938年，Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，因此获得了1938年的诺贝尔化学奖。
Kuhn工作的贡献：
▲ 证明了蛋黄叶黄素是氧化类胡萝卜素的混合物
▲ 证实了色谱法可以用来进行制备分离
l 1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色谱法
Martin和Synge用水分饱和的硅胶作固定相，以含有乙醇的氯仿作流动相，甲基橙作显色剂（指示氨基酸的位置）分离乙酰基氨基酸[5]混合物：苯丙氨酸、亮氨酸-异-亮氨酸和脯氨酸-缬氨酸-蛋氨酸等三组氨基酸。为此，Martin和Synge获得1952年度的诺贝尔奖。他们的主要贡献有：
☆ 首次提出分离过程的理论/数学处理----塔板理论，这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量地描述、评价分离过程；（1922年Peters才提出连续或填充型分馏柱可分成等效塔板（H.E.T.P.）概念）
☆ 在色谱过程中最早引入分配平衡取代吸附平衡，即采用分配色谱进行分离。该方法是由于逆流液-液萃取有困难而发明的；此外，将一种液体固定在适当的载体上，使第二种液体流过前者而实现分离，也是一个很重要的成就。
☆ 提出了色谱法进一步发展最有远见的预言：一是“流动相可用气体来代替，对分离更有好处”；二是“使用非常细颗粒的填料和柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板”。
Martin还在1944年建立了纸色谱法，1949年建立了色谱保留值和热力学常数之间的基本关系式，奠定了物化色谱的基础。
l 1958年美国生物化学家斯坦因（W.H.Stein）和莫尔（Moore）研制出氨基酸分析仪（一种低压高效液相色谱仪），并用它确定了核糖核酸的分子结构。此后，氨基酸分析仪一直成为蛋白质和酶结构的重要工具，为此他们获得了1972年诺贝尔化学奖。
l 60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制
荷瓦斯（Horvath，1967）、哈伯（Huber，1967）、科克兰（Kirkland，1969）三个研究小组分别报道高效液相色谱仪的研制，他们的主要贡献是：
☆ 高效填料：细颗粒、耐压；特别是键合固定相研制
☆ 高压泵:高精密度流量、高压和耐腐蚀流路通道（克服细填料带来的流速慢的缺点，同时加快了传质过程）
☆ 仪器检测：高灵敏度连续检测高效液相色谱的重要特征一是由经典“开放柱液相色谱”向“密闭柱液相色谱”方向发展，实现了分离分析一体化；二是色谱柱的“现代化”，即采用小颗粒高效固定相和高压泵输送流动相，强化了两相的传质，实现了高效快速分离。
这一时期，对一些高极性、大分子量、热不稳定和离子型化合物的分离也促使高效液相色谱的研究。
l 1975 年，Small,Stevens 和Baumen发表“NovelIon Exchange Chromatographic Method Using Conductimetric Detection” 一文，采用电导抑制柱-检测器检测离子交换色谱流出液，标志着离子色谱法的诞生。

发表于 2018-6-25 10:40:17

HPLC简介-2.高效液相色谱法的特点

高效液相色谱法的特点

1 高效液相色谱和气相色谱的比较

分析对象（应用）
在气相色谱一章，我们知道，气相色谱适合于分离分析那些在实验柱温下, 具有足够的挥发度, 且热稳定的物质，分子量一般不超过400。随着气相色谱技术的发展，特别是高温固定相研制，气相色谱的分析对象范围正在逐步扩大。但是对于那些没有足够的挥发度, 且热不稳定的物质，特别是一些生物样品分离分析，气相色谱则无能为力，这样的物质可能适合于液相色谱的分离分析。换句话说，只要用合适的溶剂溶解的物质，无论哪种都可成为液相色谱的分析对象。
流动相l
众所周知，流动相物态形式决定气相色谱和液相色谱的形式。但是气相色谱的载气流动相是通常是永久气体, 它仅起运载样品的作用，一般对分离结果好坏的没有影响。而液相色谱液体流动相不仅起运载样品的作用，同时对样品组分有一定的亲和力(排阻色谱除外), 它会与固定相展开对组分的剧烈竞争, 因而对分离起很大作用。换句话说，调整流动相的组成是改善液相色谱分离的另一个重要条件。操作条件选择
1）柱温：LC一般在室温下操作
2） LC的线速度比气相色谱约慢(2~3)个数量级, 虽然LC的纵向扩散可以忽略, 但“柱外效应”的重要性更为突出。
3）液体的粘度比气体大100倍, 密度大约大1000倍。LC需采用高柱前压。
4）气体可以压缩，GC的理论处理应采用压力校正因子等进行。
5）液体具有表面张力, 而气体没有, 这就成了TLC和PC展开的一个动力。
6） LC中样品回收比较容易, 可用于规模制备。
决定气相色谱分离好坏的主要操作条件固定相（色谱柱）和柱温；而决定液相色谱分离好坏的主要操作条件固定相（色谱柱）和流动相组成。

2 高效液相色谱和经典液相色谱的比较

高效液相色谱和经典液相色谱的主要差别在于分离效率高低和是否分离分析一体化。具体来说，两者固定相性质、形状及粒度，输液设备和检测手段等方面有较大的差异。
l 填料的差异经典液相色谱的填料颗粒粗（粒径大于100 μm）、形状不规则、粒度范围宽，因而存在分离效率差的缺陷。
HPLC采用具有颗粒细、粒度范围窄、能承受高压，从而达到传质阻力小, 分离效率高的（3~10）μm的高效固定相（色谱填料）。
l 流动相的推动力
经典液相色谱一般是依靠重力让溶剂流下，分离速度慢，分析时间长。而HPLC采用高压泵输送流动相，可准确控制流速，分析速度快。
l 检测方式经典液相色谱主要用于混合物的分离，一般分离和检测过程独自。而HPLC 将柱分离技术与光学检测器联用，使得液相色谱由最初的以分离目的为主，发展为可以同时完成分离分析目的的一类重要的仪器分析方法。
此外，经典液相色谱柱一次使用。而高效液相色谱柱可以反复使用。总之，高效液相色谱与经典液相色谱相比, 使用时更方便, 对操作者的依赖性更小。高效液相色谱的高重现性和连续的定量检测导致了定性和定量分析结果具有较高的准确性和精密度。

3 高效液相色谱的特点

采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器, 从而实现了高效、高速和高灵敏度、定量准确, 达到可与气相色谱相媲美的分离分析性能

发表于 2018-6-25 10:40:46

HPLC简介-3.高效液相色谱法的应用

高效液相色谱适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和天然产物；合成和高分子化合物，以及无机和有机离子型化合物。它们涉及到工业产品、农业产品、食品、药物和环境污染物等。据统计，约占80%的有机化合物可以用高效液相色谱分析，而气相色谱仅能分析其余20%的有机化合物。图3给出适合于各种高效液相色谱方法分离的分子量范围（3）。可见高效液相色谱的应用远比气相色谱广泛。目前，高效液相色谱在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保检测、商检等方面都有广泛的应用。下面就高效液相色谱的一些应用领域进行简单介绍。
　

1.4.1 在生命科学领域的应用

氨基酸、多肽、蛋白质，核碱、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等重要的生命物质，可以采用HPLC纯化和分析测定。

HPLC中的反相色谱法、排阻色谱法、亲和色谱法和离子色谱法都可用于上述生物分子的分离分析。

1.4.2 药物分析

合成药物的纯化及质量控制，中草药有效成分的分离、制备及纯度测定以及临床医学的药代动力学研究中的分离分析可采用HPLC解决。据报道, 除聚合物外, 约80%的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性药物的分离分析，HPLC已引起一个重要的分析方法。

1.4.3 食品分析

高效液相色谱在食品分析中的应用包括：①食品本身组成, 特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析；②食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析；③食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析。

1.4.4 环境监测

HPLC已在环境监测中得到广泛应用。该法特别使用于分子量大, 挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析。如多环芳烃、酚类、多氯联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药等。它已成为环境科学领域中重要的分析技术之一。

1.4.5 精细化工产品分析

对于一些具有教高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性剂、药物、农药、染料、炸药等化工产品，均可采用HPLC分析。

1.4.6 制备分离应用